EN

成功的IHC/ICC實驗操作指南(四)

實驗的每一小步,都是決定結果的一大步。本期將為大家講解IHC/ICC實驗中如何防止非特異性染色,喜歡的話就繼續往下看吧!

防止非特異性染色

用合適的方法準備和固定組織和細胞樣品之后,就可以進行染色了。所有IHC/ICC實驗都依賴于特異性的抗體-表位結合,這種結合是由疏水相互作用、離子相互作用、氫鍵和其他分子間作用力來維持的。然而,同樣這些作用力也會導致非特異性染色,即抗體會結合特異性抗原表位之外的氨基酸。這是IHC/ICC實驗中的一個普遍問題。關鍵在于要在不影響抗體-表位結合的前提下降低非特異性結合。引起非特異性結合的因素包括一抗和二抗與血清蛋白間的相互作用、抗體和組織間的離子相互作用以及抗體和能影響到所用的IHC檢測體系的內源性分子之間的相互作用。這些因素會導致高背景,使得目的抗原在相應的位置難以觀察到。使用封閉試劑封閉非特異性相互作用可以解決這類染色問題。這些需要在將樣品與一抗孵有之前進行。

防止非特異性疏水相互作用

雖然疏水相互作用對于表位抗體的結合很關鍵,但這些作用力也會促進非特異性結合。由于一些氨基酸具有中性側鏈,大多數蛋白質都有某種程度的疏水性。用熱滅活的正常血清或牛血清白蛋白(BSA)與組織孵育是一種常用的降低非特異性疏水結合的方法。正常血清類型的選擇對于防止與一抗或二抗或與待染組織/細胞的非特異性結合很重要。例如,山羊血清就不適合作為山羊來源的一抗的封閉試劑。而與二抗來源種屬相同或不相關種屬的血清則可以用于封閉。BSA和脫脂奶粉也是常用的封閉試劑。通常在一抗和二抗的稀釋液中也會加入這些試劑。非離子去污劑如0.3% Triton X-100TM或 Tween 20TM也可以降低非特異性疏水相互作用。

血清可以有效封閉非特異性結合。A. 用生物素標記的抗人CD14親和純化多克隆抗體(貨號BAF383)檢測石蠟包埋的人扁桃體組織中的CD14。使用堿性抗原修復試劑盒(貨號CTS013)修復組織抗原。用HRP標記的高靈敏度鏈霉親和素(HSS-HRP)和DAB染色并用蘇木精復染(藍色)。B. 在平行實驗中,與一抗孵育之前用動物血清室溫下封閉15分鐘顯著降低了非特異性背景染色。R&D Systems的所有細胞和組織染色試劑盒中都含有HSS-HRP和動物封閉血清。

 

細胞和組織染色試劑盒和試劑

細胞和組織染色試劑盒用于各種組織學和細胞學樣品中抗原的定位。這些試劑盒是基于親和素與結合了組織里目標抗原的一抗之間形成的和素-生物素復合物(ABC)的原理,設計成即用型的規格。包含了稀釋好的生物素標記的二抗和 HSS-HRP,無須額外的孵育步驟,減少了手工操作的時間,降低了人為估算錯誤的風險,非常方便。

防止非特異性離子相互作用

如果使用的抗體和靶組織帶有相反的凈電荷,離子相互作用就會引起非特異性背景染色。例如,相對的羧基和氨基基團之間的相互吸引、兩性分子之間的范德華力(一種弱靜電相互作用)都可以導致非特異性染色。增加固定劑和/或抗體稀釋緩沖液的離子強度可以減少離子相互作用。但是表位-抗體的結合也依賴于離子力,因此這種方法也可能降低染色的特異性。由于單表位特異性,比起多克隆抗體,單克隆抗體更容易受到離子強度降低的影響。

內源性酶的干擾

顯色檢測方法通常使用偶聯的酶使表位-抗體的相互作用顯現出來。若使用這種方法檢測,需要封閉內源性的酶活性。例如,有些實驗方案使用辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP),這就可能需要相應的試劑來封閉非特異性信號。

腎、肝或含有血管(包含紅細胞)的組織等都有內源性的過氧化物酶活性。用3-10% H2O2配制的過氧化物酶封閉試劑可以用來防止內源性過氧化物酶剪切底物。腸、腎、淋巴和其他組織中的AP酶可以用1mM的 Levamisole封閉。腸形式的AP不受 Levamisole的影響但是可以用1% 的醋酸封閉。

H2O2處理可以清除內源性過氧化物酶活性。A. 在染色前未清除內源性過氧化物酶活性的人類腎組織切片呈現出假陽性信號。組織染色用的是anti- goat HRP-DAB Cell & Tissue Stainingkit(貨號CTs0o8;褐色)。B. 同一組織在染色前于室溫下用3% H2O2的甲醇溶液處理15分鐘,去除內源性過氧化物酶活性。

內源性生物素的干擾

IHC/ICC實驗的另一種常用的檢測系統是利用鏈霉親和素與生物素標記的一抗和二抗的結合。因此,在鏈霉親和素孵育之前必須先封閉內源性生物素。許多組織中都含有內源性生物素,包括肝、腎、心、腦和肺。將樣品與親和素孵育是封閉內源性生物素的常規方法。之后必須與生物素孵育以封閉親和素分子上額外的生物素結合位點。在用生物素/親和素封閉之后,樣品便可以與一抗孵育。

 

以上文字和圖片來源于Bio-techne。

 

附件: